طريقة التخفيف بالأوساط الزرعية الصلبة:
تُعد طريقة التخفيف بالاوساط الزرعية الصلبة (Agar Plate Dilution Method)، والمعروفة أيضًا باسم طريقة العد بالطبق (Plate Count Method)، من التقنيات الأساسية والمستخدمة على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة لتقدير أعداد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للنمو (viable microorganisms) في عينة سائلة. تعتمد هذه الطريقة على تخفيف العينة الأصلية بشكل متسلسل وزراعة هذه التخفيفات على أطباق آجار صلبة، ثم عد المستعمرات الناتجة بعد فترة حضانة مناسبة لحساب تركيز الكائنات الحية الدقيقة في العينة الأصلية.
1. طريقة التخفيف التسلسلي والانتشار (Serial Dilution and Spread Plating):
تتضمن هذه الطريقة سلسلة من التخفيفات للعينّة الأصلية في وسط سائل معقم، ثم نشر كمية صغيرة من كل تخفيف على طبق بتري يحتوي على وسط زرعي صلب.
- الخطوات:
- تحضير سلسلة من التخفيفات: يتم أخذ حجم معين من العينة الأصلية وإضافته إلى حجم أكبر من المخفف المعقم (مثل الماء المقطر المعقم أو محلول ملحي). يتم تكرار هذه العملية عدة مرات لإنشاء سلسلة من التخفيفات العشرية (1:10، 1:100، 1:1000، إلخ.).
- نشر التخفيفات على الأطباق: يتم أخذ حجم صغير (عادة 0.1 مل أو 100 ميكرولتر) من كل تخفيف ونشره بالتساوي على سطح طبق بتري يحتوي على وسط زرعي صلب باستخدام عود نشر معقم.
- الحضانة: يتم حضن الأطباق في الظروف المناسبة لنمو الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في العينة.
- الملاحظة: بعد الحضانة، ستنمو المستعمرات على سطح الأطباق. كلما زاد التخفيف، قل عدد المستعمرات النامية. الهدف هو الحصول على أطباق تحتوي على عدد قليل من المستعمرات المعزولة جيدًا بحيث يمكن عدها وفحصها بشكل فردي.
2. طريقة التخطيط (Streak Plate Method):
هذه الطريقة تعتمد على التخفيف الميكانيكي للكائنات الحية الدقيقة على سطح الوسط الصلب نفسه.
- الخطوات:
- أخذ العينة: يتم أخذ كمية صغيرة من العينة باستخدام حلقة تلقيح معقمة.
- التخطيط الأولي: يتم مسح الحلقة المحتوية على العينة على جزء صغير من سطح طبق البتري المحتوي على الوسط الصلب لإنشاء المنطقة الأولى من التخطيط. يجب أن تكون هذه المنطقة كثيفة بالنمو.
- تعقيم الحلقة والتخطيط الثانوي: يتم تعقيم حلقة التلقيح باللهب وتبريدها. ثم يتم سحب بعض الكائنات الحية الدقيقة من المنطقة الأولى وتخطيطها على منطقة جديدة من الطبق، مع محاولة توزيع الخلايا بشكل أوسع.
- تكرار التخطيط مع التعقيم: يتم تكرار خطوة التعقيم والتخطيط على مناطق جديدة من الطبق (عادة ما يتم تقسيم الطبق إلى ثلاثة أو أربعة أرباع أو قطاعات). في كل مرة، يتم سحب عدد أقل من الكائنات الحية الدقيقة من المنطقة السابقة، مما يؤدي إلى تخفيف تدريجي للخلايا المنتشرة.
- الحضانة: يتم حضن الطبق في الظروف المناسبة.
- الملاحظة: بعد الحضانة، ستظهر مستعمرات معزولة في المناطق التي تم فيها تخفيف الخلايا بشكل كافٍ (عادة في الأرباع أو القطاعات الأخيرة من التخطيط).
ملاحظات هامة لكلا الطريقتين:
- العقم: يجب الحفاظ على ظروف معقمة صارمة أثناء جميع الخطوات لمنع التلوث.
- الوسط الزرعي: يجب اختيار الوسط الزرعي المناسب لنمو الكائنات الحية الدقيقة المستهدفة.
- الحضانة: يجب أن تتم الحضانة في درجة الحرارة والوقت المناسبين لنمو الكائنات الحية الدقيقة.
خلاصة:
تعتبر طريقة التخطيط أكثر شيوعًا للحصول على مستعمرات معزولة بشكل روتيني، بينما تُستخدم طريقة التخفيف التسلسلي والانتشار غالبًا لتقدير عدد الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة في العينة بالإضافة إلى الحصول على مستعمرات معزولة.
التسميات
مضادات حيوية