خطوات التصبيغ بصبغة كرام:
صبغة جرام هي إحدى أهم التقنيات المستخدمة في علم الأحياء الدقيقة لتمييز البكتيريا إلى مجموعتين رئيسيتين: موجبة الجرام وسالبة الجرام. هذا التمييز يعتمد على اختلاف تركيب جدار الخلية البكتيرية.
ويمكن تحديد خطوات صبغة جرام في:
1. تحضير الشريحة وتثبيت العينة:
- يتم أخذ عينة من البكتيريا ووضعها على شريحة زجاجية نظيفة.
- يتم تثبيت العينة على الشريحة عن طريق التسخين الجاف أو باستخدام المثبتات الكيميائية. يضمن التثبيت التصاق الخلايا بالشريحة وعدم ذوبانها أثناء عملية الصبغ.
2. التلوين الأولي (صبغة كريستال فايوليت):
- يتم تغطية الشريحة بصبغة كريستال فايوليت (بنفسجي البلوري) التي تتلون جميع الخلايا البكتيرية، سواء كانت موجبة أو سالبة الجرام.
- تترك الصبغة لمدة زمنية محددة (عادة 30 ثانية) لضمان امتصاصها جيدًا داخل جدار الخلية.
3. المعالجة باليود (محلول لوجول):
- بعد غسل الشريحة بالماء، يتم إضافة محلول لوجول (يحتوي على اليود واليوديد البوتاسيوم).
- يتفاعل اليود مع صبغة كريستال فايوليت مكونًا مركبًا غير قابل للذوبان داخل جدار الخلية للبكتيريا موجبة الجرام.
4. إزالة اللون (الكحول):
- تغسل الشريحة بالكحول (عادة إيثانول 95%).
- يؤدي الكحول إلى إذابة الدهون الموجودة في جدار الخلية للبكتيريا سالبة الجرام، مما يؤدي إلى فقدانها لصبغة الكريستال فايوليت واليود.
- بينما تحتفظ البكتيريا موجبة الجرام بصبغة الكريستال فايوليت بسبب وجود طبقة سميكة من الببتيدوجليكان في جدارها الخلوي.
5. التلوين المضاد (صبغة سافرانين):
- بعد غسل الشريحة بالماء، يتم إضافة صبغة سافرانين (حمراء اللون).
- تتلون البكتيريا سالبة الجرام التي فقدت صبغة الكريستال فايوليت باللون الأحمر، بينما تبقى البكتيريا موجبة الجرام بلونها البنفسجي الأصلي.
6. غسل وتجفيف الشريحة:
- تغسل الشريحة بالماء لإزالة بقايا الصبغة الزائدة.
- تجفف الشريحة بالهواء أو باستخدام ورق الترشيح.
7. الفحص المجهري:
- تفحص الشريحة تحت المجهر الضوئي باستخدام عدسة زيتية.
- تظهر البكتيريا موجبة الجرام باللون البنفسجي، بينما تظهر البكتيريا سالبة الجرام باللون الأحمر.
تفسير النتائج:
- البكتيريا موجبة الجرام: تظهر باللون البنفسجي الداكن بسبب احتفاظها بمعقد الصبغة الأولية واليود.
- البكتيريا سالبة الجرام: تظهر باللون الأحمر بسبب فقدانها للصبغة الأولية واكتسابها للصبغة المضادة.
أهمية صبغة جرام:
- التشخيص: تستخدم صبغة جرام بشكل روتيني في المختبرات التشخيصية لتحديد نوع البكتيريا المسببة للعدوى.
- التصنيف: تساعد في تصنيف البكتيريا إلى مجموعتين رئيسيتين بناءً على تركيب جدار الخلية.
- دراسة التركيب: توفر معلومات حول تركيب جدار الخلية والبنية الداخلية للخلية البكتيرية.
- متابعة نمو المستعمرات: تستخدم لدراسة مراحل نمو المستعمرات البكتيرية.
العوامل التي تؤثر على نتائج صبغة جرام:
- جودة الصبغات: يجب استخدام صبغات نقية وتركيزات مناسبة.
- وقت التلوين: يجب الالتزام بأوقات التلوين المحددة لكل خطوة.
- غسل الشريحة: يجب غسل الشريحة جيداً بين الخطوات المختلفة لإزالة الصبغة الزائدة.
- ثبات الشريحة: يجب تثبيت الشريحة جيداً قبل البدء بعملية التلوين.
- عمر الثقافة البكتيرية: قد تؤثر الخلايا البكتيرية القديمة على نتائج الصبغة.
ملاحظات هامة:
- يجب اتباع الخطوات بدقة للحصول على نتائج دقيقة.
- يجب استخدام صبغات طازجة وتركيزات مناسبة.
- يجب تجنب الإفراط في غسل الشريحة بالكحول، حيث قد يؤدي ذلك إلى إزالة الصبغة من البكتيريا موجبة الجرام.
- تعتبر صبغة جرام اختباراً أولياً، وقد تحتاج إلى إجراء اختبارات أخرى لتأكيد نوع البكتيريا.
خاتمة:
صبغة جرام هي أداة أساسية في المختبرات التشخيصية، ولكنها ليست الطريقة الوحيدة لتحديد نوع البكتيريا. قد تكون هناك حاجة إلى إجراء اختبارات إضافية لتأكيد التشخيص.
التسميات
سلامة